Des chercheurs du Broad Institute et de l’Université Columbia ont mis au point evoCAST, une nouvelle technologie d’édition génomique qui marque une étape importante dans le domaine. Publiée dans la prestigieuse revue Science, cette approche permet d’insérer de manière précise et efficace de très grands fragments d’ADN — dépassant les 10 kilobases — dans les cellules humaines.
Basée sur un système CRISPR associé à des transposases (CRISPR-associated transposase, CAST), evoCAST a été optimisée en laboratoire grâce à la méthode innovante de phage-assisted continuous evolution (PACE). Cette combinaison ouvre la voie à des applications thérapeutiques inédites, notamment pour des maladies génétiques complexes nécessitant l’apport de gènes entiers.
Qu’est-ce que le système CRISPR-CAST ?
Les systèmes CRISPR, originellement découverts comme mécanismes immunitaires adaptatifs des bactéries et archées, utilisent un complexe protéique guidé par ARN pour reconnaître et couper un ADN cible (p. ex. CRISPR-Cas9). Le système CRISPR-CAST est une innovation naturelle où un système CRISPR de type I-F ou de type V-K a fusionné avec un système de transposition.
Contrairement au CRISPR-Cas classique, qui génère des cassures double-brin (DSB) entraînant souvent des insertions ou délétions indésirables, le système CAST permet une intégration directe de larges segments d’ADN à un site génomique ciblé, sans casser l’ADN. Cette fusion exploite la spécificité de guidage de l’ARN du CRISPR pour positionner une machinerie de transposase qui insère précisément l’ADN souhaité, comme un « copier-coller » génétique.
Le système CAST comprend plusieurs protéines essentielles : la complexité CRISPR appelée Cascade (ensemble de protéines Cas6, Cas7, Cas8, associée à un ARN guide crRNA), qui reconnaît et se lie à la séquence cible d’ADN, et une transposase multi-subunitaire (notamment TnsA, TnsB, et TnsC) qui catalyse l’excision et l’intégration du transposon d’ADN. Le rôle de TniQ est d’assister la coordination entre Cascade et l’activité transposase.
Les limites du système naturel et l’évolution dirigée
Bien que certains systèmes CAST naturels supportent l’insertion ciblée de DNA chez les bactéries avec une efficacité quasi-parfaite, leur activité chez les cellules humaines est initialement très faible (<0.1%). Cela est dû au fait que ces transposases ont évolué pour fonctionner dans des environnements bactériens, avec une activité modérée afin de limiter les impacts négatifs pour l’hôte.
Pour surmonter cette difficulté, les chercheurs ont mis en place une méthode d’évolution continue assistée par phage (PACE) qui permet de faire muter et sélectionner en continu des variants de la transposase TnsB (et d’autres sous-unités) en E. coli pour améliorer leur efficacité. Ce processus a permis d’obtenir une transposase évoluée (notée P4-15) avec un gain d’activité supérieur à 200 fois, plus efficace dans les cellules humaines.
Les performances et caractéristiques de evoCAST
L’association de transposases évoluées avec des composants CRISPR modifiés et optimisés donne naissance à evoCAST, qui atteint des taux d’intégration ciblée de 10 à 30% dans des cellules humaines sur une variété de loci génomiques pertinents, allant des « loci sûrs » jusqu’à des gènes impliqués dans des maladies génétiques. EvoCAST supporte l’intégration de fragments d’ADN très larges (>15 kb) et présente plusieurs avantages majeurs :
- Pas de cassures double-brin de l’ADN, évitant ainsi les effets secondaires tels que mutations indésirables, délétions ou translocations.
- Haute pureté de produit : principalement des insertions simples, précises à la paire de base près, avec très peu ou pas d’indels détectés.
- Programmabilité facile via des ARN guides, permettant une adaptation rapide à différentes cibles génétiques.
- Large applicabilité : efficace dans plusieurs types cellulaires humains, y compris des fibroblastes primaires difficiles à transfecter.
- Réduction marquée de la dépendance à des protéines bactériennes cytotoxiques (ClpX) nécessaires auparavant pour améliorer la transposition.
Applications thérapeutiques et recherche
EvoCAST ouvre la voie à des thérapies mutation-agnostiques pour des maladies génétiques à perte de fonction, en offrant la possibilité d’insérer une copie saine d’un gène directement dans son locus naturel ou dans un locus dit sûr, conservant ainsi la régulation normale de ce gène. Parmi les applications démontrées figurent l’intégration du gène du facteur IX dans des cellules hépatiques pour l’hémophilie B, ou l’insertion de gènes thérapeutiques dans des cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie.
Conclusion
Le système CRISPR-CAST, optimisé dans evoCAST, combine la spécificité exceptionnelle du guidage ARN-CRISPR avec la capacité d’intégrer de larges séquences sans endommager le génome. Cette approche représente une avancée fondamentale dans le domaine de l’édition génétique, avec des potentiels thérapeutiques vastes et un profil de sécurité amélioré par rapport aux technologies basées sur les doubles cassures d’ADN.
📖 À lire dans la revue Science : Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase, par Witte et al., 2025 – DOI : 10.1126/science.adt5199
