L’intégration ciblée de transgènes via CRISPR–Cas offre un potentiel considérable pour la biotechnologie et la thérapie génique, mais demeure complexe en raison du manque de contrôle sur les mécanismes de réparation de l’ADN. Les voies classiques comme la réparation dirigée par homologie (HDR) sont limitées aux cellules en prolifération, tandis que les réparations par jonction non homologue (NHEJ) et médiée par microhomologies (MMEJ) peuvent entraîner des délétions indésirables au niveau des jonctions génome-transgène, compromettant l’intégrité génomique.
Stratégie innovante basée sur la prédiction par apprentissage profond
En exploitant la prédictibilité des résultats de réparation des cassures double brin (DSB) par MMEJ, modélisée par des algorithmes de deep learning tels que inDelphi, une nouvelle stratégie a été développée. Elle repose sur des bras réparateurs à répétitions en tandem de microhomologies (µH) adaptés au contexte séquentiel local, favorisant une intégration du transgène avec conservation du cadre de lecture et minimisation des délétions. Cette approche a été validée par modélisation in silico et expérimentations sur plusieurs loci. La conception est facilitée par l’outil Pythia.
Performances optimisées et validations in vitro/in vivo
L’intégration précise est démontrée à 32 loci dans des cellules HEK293T, avec une corrélation forte entre prédictions et séquençage des jonctions. L’approche protège le génome et le transgène des excisions, tout en augmentant l’efficience, notamment en présence de guanine à la position clé −4 du gRNA. Son efficacité est confirmée in vivo dans des embryons de Xenopus tropicalis sur le site h11, avec transmission germinale et expression stable chez les descendants. La méthode permet aussi le marquage fluorescent endogène dans Xenopus et des neurones post-mitotiques chez la souris. Enfin, le système est étendu à la création d’éditions ponctuelles scarless via ssODN basées sur les prédictions de Pythia.
Implications et perspectives pour la génomique thérapeutique
Cette approche innovante offre une intégration directionnelle, mono-copique et spécifique de locus, surpassant les méthodes basées sur NHEJ. L’utilisation de µH courts facilite la production à grande échelle et les livraisons virales. Adaptée à des cellules où HDR est inefficace, elle ouvre la voie à des thérapies géniques in vivo robustes. La modélisation prédictive Pythia permet une conception rationnelle de modèles animaux et potentiellement d’outils cliniques visant la correction ciblée de mutations pathogènes. Malgré les limites inhérentes aux cassures double brin, cette étude met en lumière une nouvelle dimension de contrôle et d’optimisation des outils CRISPR pour la réécriture génomique.
📖À lire dans la revue Nature Biotechnology : Precise, predictable genome integrations by deep-learning-assisted design of microhomology-based templates, par Naert et al., 2025 – DOI : 10.1038/s41587-025-02771-0
